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      Tag杂不出来?是否蛋白标签抗体选错了?
      文章来源:上海科兴商贸有限公司   添加时间:2020/10/22 11:51:48 点击率:1047

      做重组蛋白表达实验时,Tag杂不出来的情况很常见,这时,辛辛苦苦做的实验又得重新来过,着实懊恼!然而懊恼并没什么用,解决问题才是王道,你可以从蛋白标签抗体方面来寻找解决的办法。

      什么是蛋白标签?

      重组蛋白表达技术现已经广泛应用于生物学各个具体领域,特别是体内功能研究和蛋白质的大规模生产都需要应用重组蛋白表达载体。

      蛋白表达载体按照表达宿主的不同可分为3类,分别为:表达宿主为大肠杆菌、哺乳动物细胞,以及慢病毒载体,宿主可以为哺乳动物细胞和原代细胞。科研人员将一些肽类和蛋白质与目的蛋白融合表达,以便于目的蛋白表达、检测、示踪和纯化。这类多肽或蛋白,被称为蛋白标签(Protein Tag)。

      蛋白标签表达过程一般实验包括载体构建——表达鉴定——蛋白纯化3大步骤。在构建载体阶段,还需要考虑密码子的优化以及标签的选择。选择合适的标签,不仅要有利于蛋白的纯化,促进蛋白的可溶性,同时也不能影响蛋白的结构功能及下游应用。

      各类蛋白标签的优缺点

      除了必要的复制和筛选的元件,协助表达和翻译的元件外,各类载体分别按照功能标签的不同分为以下种类,每类蛋白标签的功能均有差异,各有优缺点,适用实验范围也各有差异。

      His6 /His-Tag

      His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签,可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用,一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力,可用于固定化金属螯合层析(IMAC),对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点:

      标签的分子量小,只有~0.84KD, 而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD,一般不影响目标蛋白的功能;

      1.His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化,前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用,后者在纯化包涵体蛋白时特别有用,用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白,使复性不受其它蛋白的干扰,或进行金属螯和亲和层析复性;

      2.His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究;

      3.His标签免疫原性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体;

      4.可应用于多种表达系统,纯化的条件温和;

      5.可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。

      Flag

      Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK),同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白,其融合表达目的蛋白后具有以下优点:

      1.Flag作为融合表达标签,其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质,这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究;

      2.融合Flag的目的蛋白,可以直接通过FLAG进行亲和层析,此层析为非变性纯化,可以纯化有活性的融合蛋白,并且纯化效率高;

      3.Flag作为标签蛋白,其可以被抗FLAG的抗体识别,这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定;

      4.融合在N端的Flag,其可以被肠激酶切除(DDDK),从而得到特异的目的蛋白。因此现FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。

      GST

      GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶,它的天然大小为26KD。将它应用在原核表达的原因大致有两个,一个是因为它是一个高度可溶的蛋白,希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性;另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达,起到提高表达量的作用。

      GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达,可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱。在大多数情况下,融合蛋白在水溶液中是可溶的,并形成二体。GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。其具有以下优点:

      1.GST标签蛋白是一个高度可溶的蛋白,增加外源蛋白的可溶性;

      2.GST标签蛋白可在大肠杆菌中大量表达,起到提高表达量的作用;

      3.GST标签蛋白很好地保留了蛋白的抗原性和生物活性,提高外源蛋白的稳定性;

      4.GST标签蛋白高特异性,纯化方便且温和。

      但GST标签蛋白较大,对目的蛋白有一定影响,可能会干扰蛋白质的功能及下游实验。

      HA

      HA标签蛋白,标签序列YPYDVPDYA,源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇,9个氨基酸,对外源靶蛋白的空间结构影响小, 容易构建成标签蛋白融合到N端或者C端。其具有以下优点:

      1.HA标签具很强的免疫反应性,被广泛用于HA融合目的蛋白的分离、纯化、检测和示踪;

      2.重组的HA标签蛋白可以使用偶联有HA高特异性单克隆抗体的树脂来完成高效纯化;

      3.HA标签系统HA标签可位于蛋白质的C端或N端,该系统已广泛应用于多种细胞类型,相应的HA标签抗体也被广泛应用,HA标签抗体能特异识别C末端或N末端带有HA标签(HA-tagged)的融合蛋白。

      c-Myc

      C-Myc标签蛋白,是一个含11个氨基酸的小标签,标签序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu,这11个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。C-Myc tag已成功应用在Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中, 可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。其特点如下:

      1.C-Myc可用于检测重组蛋白在细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳细胞中的表达情况。

      2.C-Myc重组蛋白质可通过偶联Myc标签抗体到二乙烯砜活化的琼脂糖上而进行亲和纯化。

      3.C-Myc标签可放在C端或N端,但C-Myc重组蛋白的低pH洗脱条件往往会降低蛋白质的活力,因此C-Myc标签系统广泛应用于检测但很少用于纯化。

      GFP

      GFP(绿色萤光蛋白)是由下村修等人在水母中发现的。它在蓝色波长范围的光线激发下,会发出绿色萤光。GFP标签可位于蛋白质的C端或N端,该系统已广泛应用于各种细胞类型,包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等,相应的GFP标签抗体也被广泛应用。GFP在检测蛋白表达、蛋白和细胞荧光示踪、研究蛋白质之间相互作用和构象变化中,起到了重要的作用。其优点如下:

      1.不用破碎组织细胞和不加任何底物,直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光,实时显示目的基因的表达情况,而且荧光性质稳定,被誉为活细胞探针;

      2.其自发荧光,不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况;

      3.同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测,从而使其检测更显得快速、简便、灵敏度高而且重现性。

      MBP

      MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白大小为40kDa,由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性,尤其是真核蛋白。MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。如果蛋白在细菌中表达,MBP可以融合在蛋白的N端或C端。其特点如下:

      1.简单亲和纯化;

      2.增加蛋白表达量和蛋白稳定性;

      3.促进蛋白的可溶性和正确折叠;

      4.标签较大,对目的蛋白可能会有一定影响;

      如果要去除MBP融合部分,可用位点特异性蛋白酶切除。

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